بصفته مهندسًا حيويًا يستخدم البيولوجيا الاصطناعية لدراسة طرق تحسين صحة الإنسان والكوكب، يحتاج جيويت إلى الكائنات الحية الدقيقة لتصنيع مركبات معينة أو اتباع التعليمات الجينية التي أعطاها لها. لكن الخلايا، تطورت لضمان بقائها وتكاثرها، لها أولويات أخرى. يمكن للميكروبات، على سبيل المثال، تعطيل أجزاء الحمض النووي الأجنبية – أو الجينات المحورة – التي أدخلها جيويت في الجينوم الخاص بها. أو قد يوجهون الموارد الخلوية نحو احتياجاتهم الخاصة بدلاً من توجيهها نحوها أهداف بحث جيويت.
كيف يقوم علماء الأحياء الاصطناعية ببناء مصانع حيوية أفضل
لذلك، قام بتغيير مساره. يقول جيويت، الذي يعمل في جامعة ستانفورد في كاليفورنيا: «بدلاً من محاربة لعبة شد الحبل القائمة بين ما تريد الخلايا أن تفعله وما نريد أن نفعله نحن كمهندسين، فإننا نقطع الحبل نوعًا ما». “نحن نمزق جدران خلاياها ونجمع الدواخل، ثم نستخدم الدواخل كمصنع جزيئي لتنفيذ العملية البيولوجية.”
إنها ليست فكرة جديدة: فقد ساعدت الأنظمة القائمة على التعبير البروتيني الخالي من الخلايا الباحثين على فك الشفرة الجينية في الستينيات. لكن التكنولوجيا لا تزال تتطور. يقول عالم الفيزياء الحيوية فنسنت نويروكس، الذي طوَّر فريقه في جامعة مينيسوتا في مينيابوليس نظامه الخاص: “أود أن أصفه بأنه اتجاه “متوافق” للغاية”.
على الرغم من اختلاف تركيبها، إلا أن أنظمة التعبير البروتيني الخالية من الخلايا تحتوي عمومًا على جميع الآلات اللازمة لنسخ الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي المرسال وترجمته إلى بروتينات. يمكن أن تعتمد هذه الأنظمة على ليسات الخلايا البكتيرية أو حقيقية النواة أو يتم تجميعها من مكونات نقية. تسمى التقنية الأخيرة تخليق البروتين باستخدام العناصر المؤتلفة، أو PURE.
باستخدام هذه الأساليب، يستطيع مصممو البروتين فحص مئات أو آلاف الخيارات دون تعديل الخلايا وتنميتها. وهذا يختصر دورة التصميم والبناء والاختبار والتعلم من أيام أو أسابيع إلى ساعات، كما يقول ويلسون وونج، عالِم الأحياء الاصطناعية بجامعة بوسطن في ماساتشوستس. يمكن للعلماء تصنيع مواد قد تكون سامة للخلايا الحية أو يتم مضغها أو تغييرها بواسطة إنزيمات الخلية. يقوم بعض الباحثين بتطوير تركيبات مجففة بالتجميد لإنشاء أنظمة تركيبية حسب الطلب الأدوية البيولوجية مثل اللقاحاتأو لتكون بمثابة مجموعات اختبار محمولة لاختبار جودة المياه وتشخيص نقاط الرعاية وأغراض أخرى. وفي الوقت نفسه، يستكشف علماء الأحياء الاصطناعية أنظمة PURE كنقطة انطلاق للخلايا الاصطناعية.
يقول نورو: “هناك الكثير من الأشياء التي تحدث: الكثير من التطبيقات الجديدة التي تم عرضها، وأنظمة التعبير الجيني الجديدة الخالية من الخلايا تظهر بعض الخصائص الجديدة”.
حصلت على الرصاص؟
تعد الأنظمة الخالية من الخلايا بالسرعة والتخصيص والراحة، ولكن بتكلفة. يمكن أن تكلف الكواشف اللازمة لتشغيل نظام خالٍ من الخلايا بحجم لتر واحد أكثر من 4000 دولار أمريكي، وتشير معظم الدراسات إلى أنها تنتج أقل من جرامين من البروتين، مما يجعل هذه الأنظمة أكثر تكلفة من أنظمة تخليق البروتين المعتمدة على الخلايا. ولجعل الفحص عالي الإنتاجية ميسور التكلفة، يعمل بعض الباحثين بمقاييس أقل من الميكرولتر.
وبينما يستطيع المهندسون الحيويون زراعة وعاء من البكتيريا أو الخميرة لتصنيع المنتجات المرغوبة بشكل مستمر عن طريق إزالة المنتجات وإضافة وسط جديد، فإن الأنظمة الخالية من الخلايا تستنفد إمداداتها من الطاقة بسرعة. يقول وونغ: “مهما كان ما تحاول القيام به، فيجب أن ينتهي خلال ساعات قليلة”.
يستخدم المهندس الحيوي مايكل جيويت أجهزة استشعار حيوية خالية من الخلايا لاختبار الملوثات في الماء.الائتمان: ماثيو ألين
وهذه ليست مشكلة بالنسبة لأجهزة الاستشعار الخالية من الخلايا، والتي تحتاج فقط إلى اكتشاف الجزيء محل الاهتمام وإنتاج إشارة قابلة للقياس في عشرات الدقائق. يقول يوليوس لوكس، أحد معاوني جيويت، والمدير المشارك لمركز البيولوجيا التركيبية بجامعة نورث وسترن في إيفانستون، إلينوي: “لقد طورت الطبيعة كل هذه المجسات بالفعل”. وذلك لأن الخلايا غالبًا ما تحتاج إلى التعرف على المعادن والمضادات الحيوية والجزيئات الصغيرة الأخرى والاستجابة لها. على الرغم من أن العلماء يستطيعون استخدام الخلايا كأجهزة استشعار حيوية حية، إلا أن التحديات كبيرة. يجب أن تظل الخلايا حية ويجب على الجزيئات المعنية أن تمر عبر جدار الخلية والأغشية. علاوة على ذلك، يتعرض الباحثون لخطر إطلاق الكائنات المعدلة وراثيا في البيئة.
إن الخلو من الخلايا يعني أن لاكس يمكنه بناء نظام بيولوجي بسيط دون متاعب استخدام الكائنات الحية. في عام 2020، وصفت مجموعته نظامًا محددًا كيميائيًا يسمى ROSALIND يستخدم عوامل النسخ المرتبطة بالحمض النووي كأجهزة استشعار. تمنع عوامل النسخ تخليق الحمض النووي الريبي (RNA) حتى تواجه ملوثًا محددًا أو جزيءًا محل اهتمام1. وبمجرد حدوث ذلك، يسقط البروتين من الحمض النووي ويتم نسخ الجين، مما يؤدي إلى إنتاج إشارة. وكدليل على المبدأ، نجح الفريق في اختبار أنظمة ROSALIND المجففة بالتجميد، واكتشف النحاس والزنك في العينات التي تم جمعها من أنظمة إمدادات المياه البلدية الملوثة بحرائق الغابات عام 2018 في كاليفورنيا.
كيف يمكن للعمليات الخالية من الخلايا تسريع تطوير اللقاحات
لكن التوليف الخالي من الخلايا يتألق حقًا عند تطبيقه على هندسة البروتين السريعة والمتكررة، والتي يمكن أن تتضمن تصميمات مستنيرة بالتعلم الآلي. استخدم لاكس وجيويت وزملاؤهما هذا النهج لضبط جهاز استشعار حيوي آخر يعتمد على عامل النسخ، وهذه المرة للكشف عن الرصاص.2. يعد الرصاص ملوثًا صعبًا لأن العديد من أجهزة الاستشعار التي تتعرف عليه تلتصق أيضًا بالزنك، وهو ما لا يعتبر ضارًا بشكل عام. ولصنع جهاز استشعار انتقائي للرصاص، قام الفريق بتغذية بيانات عن مجموعة واسعة من البروتينات الطافرة التي يمكنها اكتشاف الرصاص في نموذج التعلم الآلي واستخدم النتائج لتصميم المجموعة التالية من الطفرات، والتي تم اختبارها بعد ذلك في نظام خالٍ من الخلايا. وفي غضون بضع جولات، أصبح لدى الفريق جهاز استشعار قادر على اكتشاف الرصاص بنسبة تصل إلى 5.7 جزء في المليار.
يقول جيويت: “أعتقد أن الأنظمة الخالية من الخلايا ستلعب دورًا متزايد الأهمية في العلوم، نظرًا للمزايا التي تتمتع بها في تسهيل التعبير المتسارع لعشرات الآلاف إلى مئات الآلاف من البروتينات”.
تتوفر بعض أجهزة استشعار Lucks من مستودع كاشف Addgene غير الربحي. تتضمن أوراق ROSALIND الخاصة به أيضًا ملفات Microsoft Excel مع تعليمات مفصلة للتفاعلات. ويقول: “نحن نحاول حقًا أن نجعلها سهلة الاستخدام قدر الإمكان”. “إذا تمكنوا من تجميع في المختبر رد فعل على الإطلاق، يمكنهم إعداده وتشغيله.
يخنة التعبير عن البروتين
ولاختبار أجهزة الاستشعار، قام فريق جيويت بزراعة البكتيريا المختبرية الإشريكية القولونيةقام بتكسير الخلايا وفتحها واستخدم محتوياتها كحساء للتعبير عن البروتين. تقول إيميلي تشين، عالمة الإنتاج في مختبرات نيو إنجلاند بيولابس (NEB) في إيبسويتش بولاية ماساتشوستس، إنه بالمقارنة مع أنظمة PURE ، غالبًا ما تقدم مثل هذه “المحلولات” إنتاجًا أعلى بتكاليف أقل، مما يجعلها مثالية لإنتاج البروتين. على سبيل المثال، يعتمد نظام تخليق البروتين NEBExpress التابع لشركة التكنولوجيا الحيوية على الإشريكية القولونية ليساتيس.
يقول تشن إن شراء المحللات الخلوية يمكن أن يكون صفقة جيدة، خاصة بالنسبة للشركات الناشئة والمختبرات التي لا تمتلك جميع المعدات اللازمة لإنتاج البروتين المعتمد على الخلايا. تجارية أخرى الإشريكية القولونية تشمل الأنظمة MyTXTL من Noireaux ، والتي تبيعها شركة Daicel Arbor Biosciences في آن أربور، ميشيغان؛ مجموعات CFPS من شركة Ginkgo Bioworks في بوسطن؛ و CFXpress بواسطة GenScript في بيسكاتواي، نيو جيرسي. يقدم بعض مقدمي الخدمة أيضًا تركيبات يمكنها تحسين إنتاج المركبات التي يصعب التعبير عنها. على سبيل المثال، تشتمل مجموعة CFPS Premium من Gingko على مُحسِّن قابلية الذوبان للبروتينات الكبيرة بشكل خاص، أو غير القابلة للذوبان أو التي تحتاج إلى مساعدة إضافية في الطي، كما تقول سينثيا كولينز، المدير العام لوحدة أعمال كواشف Gingko.
هل ستحل “مختبرات الروبوتات” ذاتية القيادة محل علماء الأحياء؟ ورقة تثير الجدل
يمكن للباحثين الذين يتوقعون حرق الكثير من المحللات توفير المال وتخصيص الكواشف عن طريق إنشاء الكواشف الخاصة بهم، لكن نويرو يقترح أن العلماء الجدد في أنظمة التعبير البروتيني الخالية من الخلايا يجب أن يبدأوا بالمنتجات التجارية القياسية أولاً. يجب أن تستكمل Lysates ، سواء كانت محلية الصنع أو تجارية، مع مكونات مثل الجلوكوز والنيوكليوتيدات. يقول جيويت إن هذه الكواشف تساعد على استنساخ البيئة الخلوية، وتوفير الطاقة والمواد الخام اللازمة لترجمة البروتين، وتعزيز الإنتاجية. لقد وجد مختبره طرقًا لخفض التكاليف من خلال تحديد أي منها ضروري لهذه العملية. اختبر الباحثون 1231 تركيبة باستخدام lysates مصنوعة في المختبر وقاموا بتحسين الوصفة إلى 12 كاشفًا فقط. أدى هذا إلى خفض التكاليف بنسبة 95%، إلى أقل من 100 دولار لكل جرام من البروتين المنتج3.
Lysates المصنوعة باستخدام أنواع الخلايا الأخرى متاحة أيضا. توفر هذه المزايا مزايا، مثل القدرة على إكمال البروتينات بتعديلات ما بعد الترجمة، بما في ذلك السكريات أو جزيئات اليوبيكويتين، وهو ما لا تستطيع الأنظمة البكتيرية المتوفرة في الأسواق القيام به. تاريخيًا، استخدم الباحثون في كثير من الأحيان السوائل المستمدة من خلايا الدم الحمراء غير الناضجة، أو الخلايا الشبكية، التي تم الحصول عليها من الأرانب المصابة بفقر الدم. لكن هذا النموذج يثير مخاوف تتعلق بالاستخدام الأخلاقي للحيوانات ومخاوف علمية. إن عملية الترجمة الخاصة بها فريدة من نوعها، كما يحذر إيفان كاروسيس، الباحث المستقل والمحاضر في برن. على نحو غير عادي، لا تحتاج الخلايا الشبكية إلى “غطاء” mRNA لحماية mRNA وتعزيز الترجمة؛ يشرعون في الترجمة في مواقع غير قانونية؛ ولديهم إنزيمات يمكنها تحليل نسخ الحمض النووي الريبي (RNA). اضطر كاروسيس إلى إيقاف مشروع مدته ثلاث سنوات عندما اكتشف أن محلولات الخلايا الشبكية في الأرانب تستخدم طريقة غير قياسية في عملية تحلل الحمض النووي الريبي (RNA) التي كان يحقق فيها4.
يقترح كاروسيس أن الباحثين الذين يدرسون الترجمة، بدلًا من مجرد البحث عن صنع البروتينات، يجدون نظامًا متحللًا يلتصق بشكل وثيق بالبيولوجيا التي يدرسونها. ولتحقيق هذه الغاية، قامت مجموعة البحث التي قادها سابقًا في جامعة برن بتطوير تقنيات لصنع المحللات من خطوط الخلايا البشرية المختلفة. لقد قاموا بإنشاء أنظمة ترجمة خالية من الخلايا باستخدام الخلايا المشتقة من سرطان عنق الرحم (HeLa)، والكلى الجنينية (HEK-293)، والسرطانات المعروفة باسم الورم الأرومي العصبي (SH-SY5Y) والساركوما العظمية (U2OS).5. ومن بين تلك الخلايا، قدمت المحللات من خلايا هيلا الملتصقة بطبق الثقافة الترجمة الأكثر كفاءة، كما يقول.
توفر النباتات أيضًا أنظمة مريحة خالية من الخلايا، وتعتبر السوائل المأخوذة من العضيات التي تحصد الضوء في الخلايا، والتي تسمى البلاستيدات الخضراء، مفيدة بشكل خاص، كما يقول هنريك نيدرهولتماير، عالم الأحياء الاصطناعية في جامعة ميونيخ التقنية في شتراوبينج بألمانيا. وذلك لأن مهندسي الهندسة الحيوية النباتية يفضلون أحيانًا التعبير عن الجينات المحورة في البلاستيدات الخضراء بدلاً من النواة. يمكن أن تؤدي تعديلات الحمض النووي النووي إلى إسكات الجينات المحورة أو عدم القدرة على التنبؤ بتعبيرها. يعد الاحتواء البيولوجي أيضًا مصدر قلق لأن الحمض النووي النووي ينتقل في حبوب اللقاح. إن استخدام البلاستيدات الخضراء المهندسة يتجنب هذه المشاكل.
يستخدم هنريك نيدرهولتماير – عالِم الأحياء الاصطناعية بجامعة ميونيخ التقنية في شتراوبينج بألمانيا – البلاستيدات الخضراء – عضيات من الخلايا النباتية – لاختبار التغيرات الجينية في نظام خالٍ من الخلايا.الائتمان: أندرياس هيديرجوت / توم
لكن هندسة البلاستيدات الخضراء ليست سهلة، كما يقول نيدرهولتماير. وهو بطيء: لاختبار الجينات والبروتينات، يجب على العلماء الانتظار حتى تنمو النباتات. لذلك، من المفيد اختبار الجينات المحورة أو التسلسلات التنظيمية في البلاستيدات الخضراء أولاً. قامت هي وجيويت وزملاؤهما بمقارنة مستخلصات البلاستيدات الخضراء من القمح (قمح الصيف)، سبانخ (سبيناكيا أوليراسيا) والحور (حور × كانسينس)، ووجدوا أنه يمكنهم استخدام نظام السبانخ للتنبؤ بالتعبير في القمح ذي الصلة البعيدة6.
يتطلب الأمر الكثير من الأوراق للحصول على مستخلص كافٍ من البلاستيدات الخضراء فقط. تقول نيدرهولتماير إن طالبتها اشترت مخزون السبانخ بالكامل من أحد المتاجر المحلية أسبوعيًا، وقاموا بتخفيض تفاعلاتهم إلى حجم 400 نانولتر. لكن الدراسة أشارت إلى أن محلولات السبانخ والبلاستيدات الخضراء يمكن أن تكون بديلاً موثوقًا لأنواع النباتات الأخرى.
